Соглашение о предоставлении субсидии от 09.09.2014 № 14.615.21.0001 В ходе исполнения этапа проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 09.09.2014 № 14.615.21.0001 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 6 в период с 01.01.2017 по 31.12.2017 выполнены следующие работы: Показано наличие мультистабильности по напряжению при возникновении реверсов потоков мощностей на уровне распределительных сетей, исследована динамика перехода в аномальные состояния и предложены новые методы защиты, позволяющие выводить систему из таких состояний. Исследована устойчивость распределительных сетей с подколоченными к ней инверторами с регуляцией напряжения/мощности. Установлено, что для таких сетей неприменимы даже качественно критерии устойчивости, характерные для больших энергосистем. Были разработаны эффективные модели редуцированных порядков для оценки устойчивости таких сетей и явным образом проиллюстрированы причины возникновения неустойчивостей. Например, устойчивость таких сетей снижается при усилении линий в них – важный практический результат, накладывающий существенные ограничения на возможные реконфигурации таких сетей. На основе разработанных моделей редуцированного порядка были выведены полностью децентрализованные условия устойчивости имеющие большой потенциал практического применения. Проведено моделирование явления замедленного восстановления напряжения (fault induced delayed voltage recovery), и исследована динамика сетей с большим числом асинхронных двигателей. Разработаны методы мониторинга низкочастотных колебаний в сети и определения характера таких колебаний (слабозатухающие моды, вынужденные колебания, предельный цикл), а также методы определения дэмпфирующих коэффициентов генераторов и Якобиана перетоков мощности по измерениям фоновых флуктуаций фазы и напряжения. Соглашение о предоставлении субсидии от 11.11.2015 № 14.615.21.0002 Разработка высокоразрешающих карт изменений транскриптома и эпигенома мозга человека в процессе старения, реконструкция регуляторных сетей и разработка информационной модели регуляции старения коры мозга человека на уровне эпигенома и транскриптома, способной заложить основу трансляционных исследований в области разработки новых методов фармакологических и физиологических воздействий, замедляющих, предотвращающих и обращающих старение коры головного мозга человека. Сроки выполнения работ по 2 этапу: 01 января 2016 г. – 31 декабря 2016 г. Итоги выполнения работ по 2 этапу: Соглашение о предоставлении субсидии № 14.606.21.0006 от 26 сентября 2017 г. Соглашение о предоставлении субсидии № 14.606.21.0006 от 26 сентября 2017 г. В течение второго этапа работ по проекту была проведена полная биохимическая характеризация новых Cas нуклеаз, найденных биоинформатическими методами в рамках работ первого этапа. Были проведены эксперименты с бакериальными культурами, несущими изучаемые CRISPR Cas системы, а также получены рекомбинантные формы белков и проведена их биохимическая характеризация in vitro. Результаты работ показали, что белки CcCas9, DsCas9, DfCas9 и PpCas9 являются активными нуклеазами, способными вносить двунитевые разрывы в ДНК. В ходе работ были определены характерные для этих нуклеаз PAM последовальности и вид направляющих РНК, необходимых для эффективной порезки ДНК-мишеней. CcCas9, DsCas9, DfCas9 и PpCas9 обоадают короткими, относительно простыми, удобными для использования PAM последовательностями. Таким образом в соответствии с Техническим заданием и календарным планом в 2018 году по этапу № 2 «Получение и исследовательские испытания экспериментальных образцов новых нуклеаз» были получены следующие результаты: Соглашение о предоставлении субсидии от 03.10.2016 № 14.609.21.0099 Приоритетное направление: Науки о жизни (НЖ) Критическая технология: Геномные, протеомные и постгеномные технологии Период выполнения: 03.10.2016 – 30.06.2019 Исполнитель: Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования “Сколковский институт науки и технологий” Индустриальный партнер: Общество с ограниченной ответственностью “Агроплазма” Ключевые слова: Молекулярное фенотипирование, геномная селекция, широкомасштабное генотипирование, маркер-направленная селекция, масличные культуры, элитные линии подсолнечника, культивирование незрелых зародышей, культура пыльников, ДНК-чип подсолнечника Разработка лабораторной технологии маркер-направленной селекции масличных сельско-хозяйственных культур, обеспечивающей сокращение не менее чем в 2 раза срока получения селекционно-ценного материала, относительно традиционных (не маркер-направленных) схем селекции масличных культур. Отработка комплексной технологии ускоренной селекции масличных культур на культуре подсолнечника, включая выполнение исследований по следующим направлениям: – разработка системы генетических маркеров для ускоренного выведения линий полсолнечника, обладающих улучшенными показателями хозяйственно полезных признаков, – интеграция в процесс селекции технологии культивирования незрелых зародышей подсолнечника для быстрого размножения селекционно-ценного материала, – разработка технологии культивирования пыльников подсолнечника для ускоренного получения чистых линий, – получение селекционно-ценных экземпляров растений подсолнечника с улучшенными показателями отдельных хозяйственно-полезных признаков. За счет субсидии из федерального бюджета: Собрана и проанализирована научно-техническая литератур в области технологии ускоренной селекции растений. С формулирован перечень целевых хозяйственно полезных признаков подсолнечника. Проведены патентные исследования по ГОСТ 15.011-96. Разработана методика пробоподготовки селекционного материала подсолнечника и рапса для молекулярного фенотипирования и генотипирования. Разработана методика молекулярного фенотипирования селекционного материала подсолнечника и рапса. Разработана методика широкомасштабного генотипирования селекционного материала подсолнечника и рапса. Выращены донорные растения в контролируемых условиях камер искусственного климата. Введение незрелых зародышей и пыльников подсолнечника в культуру in vitro. Подобраны условия культивирования и разработка рецептур питательных сред для культивирования пыльников и незрелых зародышей подсолнечника. Разработана методика культивирования пыльников подсолнечника. Проведена пробоподготовка селекционного материала для молекулярного фенотипирования и широкомасштабного rенотипирования. Проведено молекулярное фенотипирования селекционного материала масличных культур (подсолнечник, рапс). Проведено широкомасштабное генотипирование селекционного материала масличных культур (подсолнечник, раис). Разработаны база данных молекулярных фенотипов и база данных генотипов масличных культур, в т.ч. подсолнечника. Разработана математическая модель взаимодействий фенотип/генотип по признакам качественного и количественного состава жирных кислот в семянке подсолнечника. Выявлен набор кандидатных генетических маркеров, ассоциированных с хозяйственно полезными признаками подсолнечника. Осуществлено культивирование пыльников на различных питательных средах в условиях in vitro получение морфогенных каллусных линий Проведены дополнительные патентные исследования по ГОСТ 15.011-96. Проведено генотипирование гибридов подсолнечника, фенотип которых отклоняется от фенотипа, рассчитанного с помощью математической модели, более чем на 15% и генотипирование дополнительного селекционного материала. Сделан анализ соответствия фенотипов гибридов подсолнечника результатам математического моделирования. Проведена корректировка математической модели и схем скрещивания. Создана математическая модель и схемы скрещивания. Сделана пробоподготовка биологического материала, отобранного из сегрегирующих популяций(F2) для молекулярного фенотипирования. Разработана методика адаптации растений подсолнечника, полученных путем культивирования на искусственных питательных средах in vitro, к условиям ex vitro. Разработана методика культивирования пыльников и незрелых зародышей подсолнечника на искусственных питательных средах in vitro. Проведено размножение селекционноценных генотипов подсолнечника путем культивирования зеленых проростков из незрелых зародышей в условиях in vitro. Получены экспериментальные образцы растений подсолнечника, полученных в культуре незрелых зародышей (не менее 500 шт.), охарактеризованные по морфологическим и хозяйственно-полезным признакам. Проведены дополнительные патентные исследования по ГОСТ 15.011-96. Сделаны обобщение и анализ результатов исследований. Разработан лабораторный технологический регламент маркер-направленной селекции масличных культур (подсолнечник), основанного на применении широкомасштабного генотипирования, молекулярного фенотипирования и использования культуры незрелых зародышей подсолнечника. Разработаны технологические инструкции на процессы ускоренной селекции подсолнечника. Разработан проект ТЗ на ОТР/НИОКР по теме «Промышленная селекция генома подсолнечника с заданным жирно-кислотным составом масла с использованием подходы геномной селекции». Доработаны и созданы база данных молекулярных фенотипов и база данных генотипов масличных культур. За счет внебюджетных средств Сколковского института науки и технологий: Проведено культивирование незрелых зародышей подсолнечника на искусственных питательных средах в условиях in vitro, массовое получение пробирочных растений (не менее 500 шт). Осуществлена адаптация к условиям ex vitro. Выращены фертильные растения до получения семенного материала. Определен состав и характеристики сторонних программных средств, и средств технического обеспечения, необходимых для обеспечения функционирования разрабатываемых баз данных молекулярных фенотипов и генотипов масличных культур. Разработана схема скрещиваний линий подсолнечника. Проведена пробоподготовка растительного материала подсолнечника для молекулярного фенотипирования. Проведено молекулярное фенотипирование растений подсолнечника. Отобран ценный селекционный материал подсолнечника. Проведено культивирование незрелых зародышей подсолнечника на искусственных питательных средах в условиях in vitro, массовое получение пробирочных растений (не менее 500 шт). Осуществлена адаптация к условиям ex vitro. Выращены фертильные растения до получения семенного материала. Проведено молекулярное фенотипирование селекционного материала, отобранного из сегрегирующих популяций подсолнечника. Сделан анализ соответствия фенотипов и генотипов селекционного материала, отобранного из сегрегирующих популяций подсолнечника и верификация набора генетических маркеров. Создан верифицированный набор генетических маркеров. Разработан экспериментальный образец (прототипа) ДНК-чипа для генотипирования и маркер-направленной селекции подсолнечника и его эскизно-проектная документация. Разработаны Программы и методики исследовательских испытаний экспериментального образца (прототипа) ДНК-чипа для генотипирования и маркер-направленной селекции подсолнечника и экспериментальных образцов растений подсолнечника, полученных с его использованием. Проведены исследовательские испытания экспериментального образца (прототипа) ДНК-чипа и экспериментальных образцов растений подсолнечника, полученных с его использованием. За счет средств Индустриального партнера – ООО «Агроплазма»: Выращен и отобран биоматериал контрастного по изучаемым признакам из коллекций элитных линий растений подсолнечника и рапса для генотипирования и фенотипирования. Выращен и отобран биоматериал из сегрегирующих популяций растений подсолнечника для генотипирования и фенотипирования. Характеристика исходного селекционного материала подсолнечника по хозяйственно полезным признакам. Высеивание и выращивание растений, отобранных по выявленным генетическим маркерам. Скрещивание выращенных линий растений подсолнечника согласно разработанной схемы. Отбор биологического материала, полученного в результате скрещивания линий подсолнечника. Получение экспериментальных образцов растений подсолнечника, полученных с помощью разработанной технологии маркер-направленной селекции и обладающие улучшенными хозяйственно полезными признаками. Получение сегрегирующих популяций подсолнечника (не менее 1000), в том числе с использованием технологии культивирования незрелых зародышей in vitro для ускорения селекционной схемы. Опубликовано: Мероприятия: Ф.Е. Хайтович, Выставка «Русское поле 2017», 18.10.17-20.10.17, Краснодар, Россия. Ф.Е. Хайтович, Выставка «ЮгАгро», 28.11.17-1.12.17, Краснодар, Россия. Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина, Л.А. Шундрина, С.В. Горюнова, Влияние возраста незрелых зародышей и состава питательных сред на выход жизнеспособных растений подсолнечника, Всероссийская научно-практическая конференция Кубанского отделения ВОГиС, 21.03.2018 г., Краснодар, Россия. Ф.Е. Хайтович, IV конференция «выгодная соя. Геномная селекция, агротехнологии – залог богатых урожаев», Разработка технологии ускоренной селекции масличных культур на основе высокопроизводительных методов генотипирования и молекулярного фенотипирования для обеспечения продовольственной безопасности России, 21.11.2018 г., Краснодар, Россия. Диссертация: По результатам работы по проекту была подготовлена и успешно защищена диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Чебанова Ю.В. Наследование признака среднеолеиновости масла в семенах подсолнечника: дис. на соискание уч. Степени канд.биол.наук. Дата защиты 11.12.18. На втором этапе выполнения проекта подготовлена и зарегистрирована заявка на регистрацию базы данных «База данных генотипов масличных культур» (регистрационный номер 2017146027 от 20.12.2017), на основании которой в 2018 г. получено Свидетельство о государственной регистрации№ 2018620271 (дата приоритета 20.12.2017, дата регистрации 14.02.2018). На третьем этапе выполнения проекта в 2018 г. подготовлены и поданы для регистрации в ФИПС заявка на базу данных «База данных фенотипов масличных культур» (регистрационный номер 2018621998 от 24.12.2018), на основании которой в 2019 г. получено Свидетельство о государственной регистрации№ 2019620084 (дата приоритета 24.12.2018, дата регистрации 15.01.2019), а также подготовлены и поданы для регистрации в ФИПС заявка на патент «SNP-панель для генотипирования и геномной селекции подсолнечника по содержанию жирных кислот в масле семян» (регистрационный номер 2018146443 от 26.12.2018). Соглашение о предоставлении субсидии № 14.609.21.0101 от 26 сентября 2017 г. В соответствии с Соглашением о предоставлении субсидии от 14.609.21.0101 от 26 сентября 2017 г. с Минобрнауки России (в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы») в период с 26.09.2017 по 30.12.2017 проведен первый этап прикладных научных исследований, в ходе которых выполнены следующие работы: 1. Сделан аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы.
В соответствии с Соглашением о предоставлении субсидии от 14.606.21.0006 от 26 сентября 2017 г. с Минобрнауки России (в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы») в период с 26.09.2017 по 29.12.2017 проведен первый этап прикладных научных исследований, в ходе которых выполнены следующие работы:
1. Сделан аналитический обзор современной научно-технической и методической литературы по теме исследования
2. Проведены патентные исследования
3. Разработан алгоритм поиска нуклеаз известных классов и идентификации последовательностей, кодирующих отдельные нуклеазные домены известных типов.
4. Поведен биоинформатический поиск последовательностей нуклеазных доменов и малых нуклеаз известных классов в геномах бактерий.
5. Получен набор последовательностей генов нуклеаз, перспективных для редактирования генома
6. Получена одна нуклеаза-кандидат и проведены ее исследовательские испытания на предмет определения механизмов их ферментативной (нуклеазной) активности в бактериальных клетках и in-vitro, а также их биохимическая характеризация.
7. Получены экспериментальные образцы AAV частиц (без гена нуклеазы) для исследовательских испытаний на предмет пригодности в качестве средства доставки гена нуклеазы в клетку человека.
8. Проведены исследовательские испытания AAV частиц на предмет стабильности, возможности заражения клеток (доставки).
Проверка активности нуклеаз в редактировании эукариотического генома показала способность DfCas9 и DsCas9 вносить разрывы в геномную ДНК. Эффективность этих белков а также белков CcCas9 и PpCas9 планируется улучшить элиминацией протеолитических сайтов в последовательностях белков, а также модификацией векторов и способа трансфекции, в связи с чем были начаты подготовительные работы.
В ходе второго этапа проекта был разработан проект лаборатрного регламента получения препарата для генной терапии миодистрофии Дюшенна. Кроме того были оптимизированы условия роста культуры миоцитов человека, а также получена культура миоцитов, несущая мутацию в DMD гене, которая будет служить модельной линией клеток для тестирования препарата.
По результатам работ были поданы две заявки на патенты, напечатано две публикации, а также обеспечено участие исполнителей проекта в ряде мероприятий, обеспечивающих освещение результатов ПНИ.
На следующем этапе проекта будет проверена специфичность разрабатываемых нуклеаз, а также проведены работы по созданию экспериментального образца препарата на основе вирусных AAV частиц и Cas нулеаз для лечения миодистрофии Дюшенна.
1.Разработаны программы и методики и проведены исследовательские испытания бактериальных культур, несущих новые системы, на предмет роста в различных условиях их культивирования, включая эксперименты по заражению чужеродными нуклеиновыми кислотами ;
2. Получены экспериментальные образцы генетических конструкций для выделения и очистки исследуемых белков на основе синтетических последовательностей генов, кодирующих перпективные нуклеазы-кандидаты;
3. Получены экспериментальные образцы рекомбинатных форм 1-ой партии нуклеаз-кандидатов;
4. Разработаны программы и методики и проведены исследовательские испытания рекомбинатных форм 1-ой партии нуклеаз-кандидатов с целью их биохимической характеризации включая исследовангия оп определению PAM последовательностей и последовательностей направляющих РНК;
5. Получены экспериментальные образцы рекомбинатных форм 2-ой партии нуклеаз-кандидатов;
6. Разработаны программы и методики и проведены исследовательские испытания рекомбинатных форм 1-ой партии нуклеаз-кандидатов с целью их биохимической характеризации включая исследовангия оп определению PAM последовательностей и последовательностей направляющих РНК;
7. Проведены работы по материально-техническому снабжению проекта;
8. Обеспечено участие в мероприятиях, направленных на освещение результатов ПНИ;
9.Разработаны схемы клонипрования генетических векторов и их получение для первичного тестирования нуклеаз-кандидатов в эукариотических клетках;
10. Разработаны программа и методики и проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов генетических векторов, кодирующие нуклеазы 1-ой партии в клектах человека на предмет оценки активности нуклеаз в редактировании эукариотического генома клеток HEK293 в генах Grin2b и VEGFA;
11. Разработаны программа и методики и проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов генетических векторов, кодирующие нуклеазы 2-ой партии в клектах человека на предмет оценки активности нуклеаз в редактировании эукариотического генома клеток HEK293 в генах Grin2b и VEGFA.
12. Выявлены основные нуклеазы-кандидаты, активные в клетках человека.
13. Была проведена корректировка генетических векторов по результатам исследовательских испытаний
14. Разарботаны программа и методики и проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов генетических векторов, кодирующих нуклеазы-кандидаты в миоцитах человека на предмет оценки активности нуклеаз в редактировании мутаций в DMD гене.
15. Разработан проект лабораторного регламента получения препарата для генной терапии миодистрофии Дюшенна.
16. Получены экспериментальные образцы культуры миоцитов, несущей мутацию в DMD гене.
17. Разработаны программа и методики и проведены исследовательские испытания миоцитов человека на предмет эффективности роста в различных условиях их культвирования.
План работ в 2018 г. по этапу № 2 выполнен в соответствии с Техническим заданием и Календарным планом в полном объеме.
2. Проведены патентные исследования.
3. Проведен сравнительный анализ универсальности и разрешающей способности различных маркерных участков генома растений, выбран маркер для анализа состава продуктов питания, содержащих растительные компоненты.
4. Разработана методика выделения ДНК из чая и чайных напитков из растительного сырья, сухих смесей лекарственных растений и специй
5. Разработаны технические требования к программному обеспечению для анализа данных высокопроизводительного секвенирования ДНК-маркеров и генерации отчета о составе сложных смесей
6. Согласно разработанным требованиям разработано программное обеспечение.
7. Создана база данных референсных последовательностей ДНК-маркеров растений.
8. Проведены теоретические исследования по определению параметров точности и чувствительности разрабатываемых методик
9. Создана коллекция референсных препаратов ДНК из образцов растений известного происхождения, охарактеризованных качественно и количественно.
10. Разработана лабораторная методика приготовления ДНК-библиотек маркерных последовательностей растений ITS1, направленная на определение видового состава растений, входящих в состав пищевой продукции растительного происхождения в образцах, содержащих малодеградированную ДНК с помощью платформы Illumina
11. Разработана лабораторная методика приготовления ДНК-библиотек маркерных последовательностей растений ITS1, направленная на определение видового состава растений, входящих в состав пищевой продукции растительного происхождения в образцах, содержащих малодеградированную ДНК с помощью полупроводникового секвенирования
12. С помощью разработанных методик определен состав образцов чая и чайных напитков из растительного сырья, сухих смесей лекарственных растений и специй (6 образцов в 3 повторностях).
13. Проведена оценка копийности ДНК-маркеров в геномах референсных растений
14. Разработана программа и методика исследовательских испытаний, направленных на определение параметров точности и чувствительности разработанных лабораторных методик и ПО
15. Проведена оценка уровня деградации ДНК в различных типах пищевой продукции, представляющих собой растительные смеси
16. Проведены исследовательские испытания лабораторных методик и ПО на искусственно созданных смесях из референсных препаратов ДНК на двух платформах высокопроизводительного секвенирования.
17. С помощью разработанных методик проведено исследование 32 образцов пищевой продукции, содержащих малодеградированную ДНК на двух платформах высокопроизводительного секвенирования.