Карта Тибетского автономного района Китая. Четырьмя треугольниками (▲) отмечены места забора образцов воды, а перевёрнытыми треугольниками (▼) — почв. На уменьшенной карте в рамке показано расположение Тибета (красный) относительно территории остальной части Китая (голубой). На четырёх спутниковых снимках справа — исследованные озёра. Источник: отредактированная графика из статей Шао Вэй Лю и др. в Microorganisms и Лифан Лю и др. в Frontiers in Microbiology
Образцы отправили в Пекинскую ключевую лабораторию противомикробных агентов. Содержащиеся в воде и почве микроорганизмы культивировали в богатой питательными веществами среде. Полученные культуры протестировали на предмет противомикробной активности. Некоторые бактерии, как оказалось, действительно вырабатывали антибиотики. Эти штаммы подверглись генетическому анализу, а также проверке: убивают ли они ряд известных патогенов человека.
На следующем этапе исследования сухие экстракты содержащих антибиотики культуральных жидкостей прибыли в Сколтех, и Лукьянов с коллегами стали выяснять задействованные механизмы противомикробной активности при помощи так называемой репортерной системы. Её разработал совместно с коллегами соавтор обоих российско-китайских исследований Пётр Сергиев — профессор Центра молекулярной и клеточной биологии Сколтеха.
«Антибиотики могут вредить бактериям по-разному: воздействуя на синтез белка, репликацию ДНК, транскрипцию РНК, синтез клеточной стенки или ключевые процессы обмена веществ, — поясняет Лукьянов. — В Сколтехе и МГУ сделали репортерную систему, которая позволяет различать соединения с двумя механизмами действия: подавляющие производство белка бактерией и влияющие на репликацию ДНК либо транскрипцию РНК». Все прочие механизмы в данном случае выделяют в общую третью категорию.
Для определения механизма, задействованного в каждом отдельно взятом случае, в системе используется двойной «репортерный штамм» кишечной палочки. Этот лабораторный штамм искусственно лишён некоторых защитных механизмов, что позволяет лучше различать и измерять эффект от воздействия антибиотиков.
Коллектив из Сколтеха культивировал репортерный штамм в чашках Петри и подверг его воздействию тибетских экстрактов культуральных жидкостей, а также контрольных соединений — стандартных антибиотиков с двумя разными и заведомо известными механизмами действия. На основании того, насколько опасными исследованные вещества оказались для репортерного штамма по сравнению с контрольными антибиотиками, учёные определили механизмы воздействия.
Затем исследователи применили хроматографию и масс-спектрометрию — два высокоточных метода анализа состава смесей — и установили, какие именно химические соединения входят в состав экстрактов. Оказалось, что вода из солёных озёр содержит хадамицины и кидамицины, а образцы тибетской почвы — рифамицины.
«Соединения из этих групп уже известны как антибиотики, но всё равно их присутствие в столь удалённом и высокогорном регионе — это в некотором смысле неожиданность, — комментирует находку Лукьянов. — В подобных естественных средах могут скрываться и неизвестные антибиотики. Быть может, нам повезёт найти их в следующий раз».